PCR技術(shù)在基層疾控中心實驗室的應用案例
四川華銳凈化 2019-03-31 13:30:39 閱讀
【摘要】目的 為了具備病毒核酸檢測能力，對流感病毒和手足口病毒進行鑒定和分型。方法 1申請資金建立PCR實驗室；2 RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在流感和手足口病毒檢測中的應用；結(jié)果 1 2009年寧夏吳忠市PCR實驗室建成投入使用；2流感樣常規(guī)監(jiān)測、暴發(fā)疫情快速確診流感病毒類型，熒光定量PCR技術(shù)和雙重熒光定量PCR技術(shù)對手足口病樣核酸鑒定和分型。結(jié)論 吳忠市PCR實驗室的建立，RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實驗室的運用，吳忠市疾控中心實驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎(chǔ)。建立基層PCR實驗室不盡是基層實驗室能力建設的一個巨大飛躍，更是在現(xiàn)代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
【關(guān)鍵詞】PCR實驗室 基層 建立 現(xiàn)狀 應用
PCR技術(shù)是一種快速DNA片段擴增技術(shù)，具有高靈敏性、高特異性、簡便、快速以及對標本質(zhì)量要求較低的特點，已經(jīng)成為一種對標本中的特定DNA片段進行研究和檢測鑒定的重要方法，被廣泛用于病毒學診斷，尤其是病毒性疾病的早期診斷[1]。Real-time PCR是新研制出的一種核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在RT-PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針來實現(xiàn)其定量功能的，在PCR反應系統(tǒng)中引入了熒光標記探針具有高靈敏性、高特異性和高精確性的特點。PCR 技術(shù)在基層疾控中心的開展，提高了基層實驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎(chǔ)，在現(xiàn)代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吳忠市疾控中心申請建立PCR實驗室。
吳忠市PCR實驗室的建立有其歷史必要性。2009甲型H1N1流感爆發(fā)引發(fā)的相關(guān)疾病死亡，給人類生命財產(chǎn)和社會經(jīng)濟發(fā)展帶來災難性的打擊。在當年的5月，還沒有特效治療的藥物，尚無有效的預防疫苗，相關(guān)的疫苗研發(fā)正在進行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趨勢，引起全球人民的高度恐慌。我國密切關(guān)注甲型H1N1流感的發(fā)生和傳播，各級疾控中心加強監(jiān)測和檢測，及時應對疫情的發(fā)生。面對可能大規(guī)模爆發(fā)的流感疫情，我們的實驗室檢測工作已經(jīng)無法解決對疫情病毒的確診工作，無法滿足這種空前危機的局勢,擴大流感檢測實驗室，應對疫情危機已經(jīng)是迫在眉睫的問題。實驗室檢測是確診流感病例的重要依據(jù)，為進一步加強疫情監(jiān)測，嚴防疫情擴散，需逐步將現(xiàn)有流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室擴大到所有地市級疾病預防控制中心，因此建立基層PCR實驗室是這種歷史時期的必然趨勢。
PCR實驗室是分子生物實驗室，因其技術(shù)參數(shù)條件高，造價昂貴，開展工作耗資巨大，因此很難在基層實驗室建立。2009年，在特定的歷史時期，寧夏吳忠市疾控中心積極向上級部門和地方政府匯報建立PCR實驗室的必要性，并申請項目資金，申請審批在吳忠市疾控中心建立PCR實驗室。
1.2 RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實驗室的運用。
寧夏吳忠市PCR實驗室按照標準配置了普通PCR擴增儀、定量Real-time實時熒光PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、倒置顯微鏡、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超凈工作臺、低溫冷凍離心機、培養(yǎng)箱、高壓鍋、-70攝氏度低溫冷凍冰箱、純水儀等儀器設備30余件。
在PCR實驗室建設同時，吳忠市疾控中心先后派出2名專業(yè)技術(shù)人員到寧夏自治區(qū)疾控中心病毒實驗室進行了專項培訓，通過考核，獲得了上崗證書。
2009年11月22日，經(jīng)過寧夏回族自治區(qū)疾控中心專家的現(xiàn)場流感樣盲樣的考核驗收，達標后以RT-PCR技術(shù)開展流感核酸檢測工作開始正式投入使用，標志著PCR技術(shù)首次在基層實驗室的開展。
2 結(jié)果
2.1 在國家和地方政府的大力支持下，在單位領(lǐng)導的努力和各位專家的指導下，吳忠市PCR實驗室于同年11月份建成。
寧夏吳忠市PCR實驗室嚴格按照生物安全Ⅱ級的要求在市疾控中心進行設計和建設。 PCR技術(shù)基本原理就是將感樣本的特異基因組核酸基因片段通過聚集、提取、擴增，分析其擴增產(chǎn)物來確定流感病毒的類型。完成一組PCR實驗，通常應經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程[3]。
寧夏吳忠市疾控中心的PCR實驗室在環(huán)境結(jié)構(gòu)上是組合形式的PCR實驗室，是指完成PCR四個實驗過程的實驗和用房是相鄰布置的，組成獨立實驗區(qū)域的形式。實驗室設有PCR內(nèi)部專用走廊。實驗室間有試劑配制室、樣品處理室、核酸擴增室及核酸擴增產(chǎn)物分析室組成。各室在入口處設置有緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。我中心的PCR實驗室是通過獨立的送排風系統(tǒng)，控制氣流方向和壓差，氣流由清潔區(qū)流向污染區(qū) 。
2.2 目前，吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)承擔來自哨點醫(yī)院（吳忠市人民醫(yī)院）的發(fā)熱病人的流感樣樣本的常規(guī)檢測，同時還擔負著整個吳忠市轄區(qū)暴發(fā)集體發(fā)熱疫情的現(xiàn)場快速檢測及實驗室確診檢測工作，確診流感病毒類型及分型。運用Real-time PCR技術(shù)和雙重Real-time PCR技術(shù)對本手足口病樣核酸鑒定和分型。對流感樣和手足口病樣核酸檢測，吳忠市PCR實驗室檢測的陽性樣品，全部都及時送到寧夏回族自治區(qū)疾控中心病毒科實驗室復核，結(jié)果一致，沒有出現(xiàn)結(jié)果異?；蛘呤遣环锨闆r。國家流感中心在2009年10月和2010年10月，兩次組織對國家流感網(wǎng)絡絡實驗室分別進行為數(shù)10份的流感盲樣標本分型考核，盲樣考核樣品由國家流感中心統(tǒng)一提供。吳忠市疾控中心流感網(wǎng)絡實驗室的考核盲樣結(jié)果符合率均為100%，順利通過，這是對工作人員盡快掌握RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)的肯定。吳忠市PCR實驗室自建成開展工作以來，無安全事故發(fā)生，沒有檢測結(jié)果錯誤情況，一切運轉(zhuǎn)正常。
3 結(jié)論：
3.1 吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)檢測包括甲型H1N1流感在內(nèi)的各種流感病毒核酸，及時確診流感病毒的類型及其亞型，為流感疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，為提高我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐。
3.2 在吳忠市PCR實驗室運用熒光定量PCR技術(shù)和雙重熒光定量PCR技術(shù)檢測手足口病核酸分型，暴發(fā)疫情快速確診腸道病毒類型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，為疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，同時為臨床診斷以及制定預防措施提供依據(jù)。
3.3 吳忠市PCR實驗室，作為一個分子診斷實驗室，能夠為將來開展PCR技術(shù)支持的任何其它病毒核酸檢測提供實驗環(huán)境，在今后的發(fā)展中將會發(fā)揮其最大效應，也許在不久的將來，丙肝病毒、艾滋病毒、乙腦病毒、輪狀病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、風疹病毒等需要PCR技術(shù)支持病毒核酸檢測都能夠在吳忠市疾控中心這樣的基層PCR實驗室完成。PCR技術(shù)在吳忠市疾控中心實驗室的運用，提高了實驗室的技術(shù)能力，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎(chǔ)。。
寧夏吳忠市PCR實驗室的建成啟用，極大地提高了我市流感傳染病和手足口病診斷的及時性和準確性，對有效預防控制流感病毒和手足口病傳染病發(fā)揮重要的指導性作用。RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實驗室的運用，吳忠市疾控中心實驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎(chǔ)。建立基層PCR實驗室不盡是基層實驗室能力建設的一個巨大飛躍，更是在現(xiàn)代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
【關(guān)鍵詞】PCR實驗室 基層 建立 現(xiàn)狀 應用
PCR技術(shù)是一種快速DNA片段擴增技術(shù)，具有高靈敏性、高特異性、簡便、快速以及對標本質(zhì)量要求較低的特點，已經(jīng)成為一種對標本中的特定DNA片段進行研究和檢測鑒定的重要方法，被廣泛用于病毒學診斷，尤其是病毒性疾病的早期診斷[1]。Real-time PCR是新研制出的一種核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在RT-PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針來實現(xiàn)其定量功能的，在PCR反應系統(tǒng)中引入了熒光標記探針具有高靈敏性、高特異性和高精確性的特點。PCR 技術(shù)在基層疾控中心的開展，提高了基層實驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎(chǔ)，在現(xiàn)代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吳忠市疾控中心申請建立PCR實驗室。
吳忠市PCR實驗室的建立有其歷史必要性。2009甲型H1N1流感爆發(fā)引發(fā)的相關(guān)疾病死亡，給人類生命財產(chǎn)和社會經(jīng)濟發(fā)展帶來災難性的打擊。在當年的5月，還沒有特效治療的藥物，尚無有效的預防疫苗，相關(guān)的疫苗研發(fā)正在進行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趨勢，引起全球人民的高度恐慌。我國密切關(guān)注甲型H1N1流感的發(fā)生和傳播，各級疾控中心加強監(jiān)測和檢測，及時應對疫情的發(fā)生。面對可能大規(guī)模爆發(fā)的流感疫情，我們的實驗室檢測工作已經(jīng)無法解決對疫情病毒的確診工作，無法滿足這種空前危機的局勢,擴大流感檢測實驗室，應對疫情危機已經(jīng)是迫在眉睫的問題。實驗室檢測是確診流感病例的重要依據(jù)，為進一步加強疫情監(jiān)測，嚴防疫情擴散，需逐步將現(xiàn)有流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室擴大到所有地市級疾病預防控制中心，因此建立基層PCR實驗室是這種歷史時期的必然趨勢。
PCR實驗室是分子生物實驗室，因其技術(shù)參數(shù)條件高，造價昂貴，開展工作耗資巨大，因此很難在基層實驗室建立。2009年，在特定的歷史時期，寧夏吳忠市疾控中心積極向上級部門和地方政府匯報建立PCR實驗室的必要性，并申請項目資金，申請審批在吳忠市疾控中心建立PCR實驗室。
1.2 RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實驗室的運用。
寧夏吳忠市PCR實驗室按照標準配置了普通PCR擴增儀、定量Real-time實時熒光PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、倒置顯微鏡、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超凈工作臺、低溫冷凍離心機、培養(yǎng)箱、高壓鍋、-70攝氏度低溫冷凍冰箱、純水儀等儀器設備30余件。
在PCR實驗室建設同時，吳忠市疾控中心先后派出2名專業(yè)技術(shù)人員到寧夏自治區(qū)疾控中心病毒實驗室進行了專項培訓，通過考核，獲得了上崗證書。
2009年11月22日，經(jīng)過寧夏回族自治區(qū)疾控中心專家的現(xiàn)場流感樣盲樣的考核驗收，達標后以RT-PCR技術(shù)開展流感核酸檢測工作開始正式投入使用，標志著PCR技術(shù)首次在基層實驗室的開展。
2 結(jié)果
2.1 在國家和地方政府的大力支持下，在單位領(lǐng)導的努力和各位專家的指導下，吳忠市PCR實驗室于同年11月份建成。
寧夏吳忠市PCR實驗室嚴格按照生物安全Ⅱ級的要求在市疾控中心進行設計和建設。 PCR技術(shù)基本原理就是將感樣本的特異基因組核酸基因片段通過聚集、提取、擴增，分析其擴增產(chǎn)物來確定流感病毒的類型。完成一組PCR實驗，通常應經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程[3]。
寧夏吳忠市疾控中心的PCR實驗室在環(huán)境結(jié)構(gòu)上是組合形式的PCR實驗室，是指完成PCR四個實驗過程的實驗和用房是相鄰布置的，組成獨立實驗區(qū)域的形式。實驗室設有PCR內(nèi)部專用走廊。實驗室間有試劑配制室、樣品處理室、核酸擴增室及核酸擴增產(chǎn)物分析室組成。各室在入口處設置有緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。我中心的PCR實驗室是通過獨立的送排風系統(tǒng)，控制氣流方向和壓差，氣流由清潔區(qū)流向污染區(qū) 。
2.2 目前，吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)承擔來自哨點醫(yī)院（吳忠市人民醫(yī)院）的發(fā)熱病人的流感樣樣本的常規(guī)檢測，同時還擔負著整個吳忠市轄區(qū)暴發(fā)集體發(fā)熱疫情的現(xiàn)場快速檢測及實驗室確診檢測工作，確診流感病毒類型及分型。運用Real-time PCR技術(shù)和雙重Real-time PCR技術(shù)對本手足口病樣核酸鑒定和分型。對流感樣和手足口病樣核酸檢測，吳忠市PCR實驗室檢測的陽性樣品，全部都及時送到寧夏回族自治區(qū)疾控中心病毒科實驗室復核，結(jié)果一致，沒有出現(xiàn)結(jié)果異?；蛘呤遣环锨闆r。國家流感中心在2009年10月和2010年10月，兩次組織對國家流感網(wǎng)絡絡實驗室分別進行為數(shù)10份的流感盲樣標本分型考核，盲樣考核樣品由國家流感中心統(tǒng)一提供。吳忠市疾控中心流感網(wǎng)絡實驗室的考核盲樣結(jié)果符合率均為100%，順利通過，這是對工作人員盡快掌握RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)的肯定。吳忠市PCR實驗室自建成開展工作以來，無安全事故發(fā)生，沒有檢測結(jié)果錯誤情況，一切運轉(zhuǎn)正常。
3 結(jié)論：
3.1 吳忠市PCR實驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)檢測包括甲型H1N1流感在內(nèi)的各種流感病毒核酸，及時確診流感病毒的類型及其亞型，為流感疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，為提高我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐。
3.2 在吳忠市PCR實驗室運用熒光定量PCR技術(shù)和雙重熒光定量PCR技術(shù)檢測手足口病核酸分型，暴發(fā)疫情快速確診腸道病毒類型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，為疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，同時為臨床診斷以及制定預防措施提供依據(jù)。
3.3 吳忠市PCR實驗室，作為一個分子診斷實驗室，能夠為將來開展PCR技術(shù)支持的任何其它病毒核酸檢測提供實驗環(huán)境，在今后的發(fā)展中將會發(fā)揮其最大效應，也許在不久的將來，丙肝病毒、艾滋病毒、乙腦病毒、輪狀病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、風疹病毒等需要PCR技術(shù)支持病毒核酸檢測都能夠在吳忠市疾控中心這樣的基層PCR實驗室完成。PCR技術(shù)在吳忠市疾控中心實驗室的運用，提高了實驗室的技術(shù)能力，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎(chǔ)。。
寧夏吳忠市PCR實驗室的建成啟用，極大地提高了我市流感傳染病和手足口病診斷的及時性和準確性，對有效預防控制流感病毒和手足口病傳染病發(fā)揮重要的指導性作用。RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實驗室的運用，吳忠市疾控中心實驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學有效的數(shù)據(jù)，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學在基層實驗室開展研究奠定基礎(chǔ)。建立基層PCR實驗室不盡是基層實驗室能力建設的一個巨大飛躍，更是在現(xiàn)代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
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